Development and application of omics technologies for the monitoring of personalized therapeutic protocols

Durante il primo anno di dottorato l’attività scientifica è stata finalizzata a sviluppare un protocollo sperimentale teso a valutare il possibile coinvolgimento della Sortilina (Sort), una glicoproteina di membrana, nella modulazione del pathway degli sfingolipidi nell’ambito dell’ipertensione. L’analisi lipidomica è stata condotta mediante un approccio mirato (targeted) ed uno hypothesis-free (untargeted). Nel dettaglio, lo studio di lipidomica targeted ha valutato la possibile correlazione tra i livelli plasmatici di Sort e degli sfingolipidi: Sfingosina-1-fosfato (S1P), Ceramide C16, Ceramide C18, Ceramide C24:1. Il protocollo analitico-estrattivo è stato ottimizzato a partire da cellule endoteliali di vena ombelicale umana e, successivamente, applicato ad una piccola coorte di pazienti normotesi ed ipertesi. I risultati hanno evidenziato una possibile correlazione tra i livelli plasmatici di Sort e S1P, identificando quest’ultima come co-responsabile degli alti livelli di pressione arteriosa. Successivamente, al fine di ottenere informazioni circa le possibili alterazioni lipidiche nel plasma di pazienti ipertesi, è stato ottimizzato un metodo di infusione diretta con l’impiego del sistema FT-ICR. L’analisi statistica preliminare ha evidenziato, in soggetti ipertesi, alterazioni nei livelli plasmatici di alcuni sfingolipidi, come sfinganine e deossi-ceramidi. Nel corso del secondo anno di dottorato, per rafforzare l’ipotesi circa il coinvolgimento degli sfingolipidi e della sortilina nell’ipertensione, è sato condotto uno studio su una coorte più numerosa di soggetti. Quest’ultima ha arruolato 270 pazienti equamente divisi in: normotesi ed ipertesi responsivi o meno al trattamento farmacologico. I risultati hanno confermato le indicazioni ottenute dallo studio pilota. Infatti, è stato osservato un aumento statisticamente significativo delle concentrazioni plasmatiche di Sort e S1P nel plasma di soggetti ipertesi. L’ipertensione rappresenta inoltre uno dei principali fattori di rischio per l’insorgenza di patologia infiammatorie, come l’aterosclerosi. Per tal motivo, il metodo per l’analisi untargeted (nano-FT-ICR) precedentemente sviluppato, è stato applicato per monitorare gli effetti di un nuovo peptide ad attività antiipertensiva, rinominato SP6, nella modulazione dell’aterosclerosi in modelli di topi ApoE−/− . L’analisi statistica ha messo in luce alcuni pathways su cui sembra agire SP6, ossia: il metabolismo di sfingolipidi e glicerofosfolipidi, la biosintesi degli acidi grassi, il ciclo degli acidi tricarbossilici ed il metabolismo di glutammato e glutammina. Nel corso del terzo anno di dottorato, la trapped ion mobility mass spectrometry (TIMS) è stata impiegata per valutare alterazioni lipidiche connesse sia ad una grave forma di paraplegia spastica ereditaria quale la sindrome da carenza del complesso AP-4, sia ad una patologia virale come l’infezione da SARS-CoV-2. I neuroni di pazienti affetti dalla sindrome di carenza del complesso AP-4 presentano delle alterazioni strutturali dovute a difetti nella crescita degli assoni. Recenti studi hanno candidato la diacilgicerolo-lipasi-beta (DAGLB), l’enzima chiave per la generazione del 2- arachidonoilglicerolo (2-AG), come una nuova possibile proteina cargo di AP-4. L’attività di ricerca ha permesso di osservare livelli cerebrali di 2-AG significativamente più bassi in topi carenti del complesso AP-4, confermando così l’ipotesi che la DAGLB sia una nuova proteina cargo di AP-4, responsabile insieme a 2-AG del danno neuronale. L'identificazione di possibili markers prognostici, in gradi di predire il decorso di una patologia, rappresenta uno dei principali obiettivi della lipidomica. Dunque, abbiamo ipotizzato che i cambiamenti metabolici nel plasma di pazienti positivi al Covid-19 possano essere precedenti ai cambiamenti clinici e, perciò, potenzialmente impiegabili per scopi prognostici. Infatti, abbiamo identificato una significativa e progressiva riduzione dei livelli plasmatici di Lisofosfatidilcoline ed Alchil-lisofosfatidilcoline già al momento dell’ospedalizzazione dei pazienti, che sembra quindi poter essere in grado di prevedere l’outcome dei pazienti. Infine, durante l’ultimo di dottorato, abbiamo lavorato per adattare il sistema EvosepOne LC alle sfide della lipidomica e ne abbiamo valutato la performance in combinazione con uno spettrometro di massa TIMS-qTOF. Tale piattaforma cromatografica permette di unire i vantaggi della nanoionizzazione con quelli derivanti dall’impiego di un alto flusso delle fasi mobili (1µL/min). Il sistema EvosepOne LC incorpora gli analiti in un gradiente preformato che è poi spinto attraverso la colonna cromatografica da una singola pompa ad alta pressione. I nostri risultati offrono nuove opportunità per un’analisi lipidomica ad elevate prestazioni nell’ambito della ricerca biomedica. [a cura dell'Autore]