In vitro myogenic models using human bone marrow mesenchymal stem cells: from 2d static to bioengineered 3d dynamic co-cultures

Skeletal muscle injuries can spontaneously heal, because of an intrinsic regenerative potential of a resident stem cell pool, known as satellite cells. After injury, quiescent satellite cells start proliferating and differentiating toward mature muscle cells. Immune cells also play a central role in skeletal muscle regeneration process, by switching from a pro-inflammatory to an anti-inflammatory microenvironment, as healing process proceeds, and injured muscle is structurally and functionally recovered. However, skeletal muscle regenerative potential is limited, and severe injuries frequently result in incomplete recovery and chronic inflammation. Current therapies are restricted to conservative management, including RICE protocol (rest, ice, compression, and elevation) and nonsteroidal anti-inflammatory drugs or intramuscular corticosteroids for inflammatory symptom relief. These approaches do not provide a complete restoration to preinjury status, thus cell-based approach may represent a valid treatment option, even if these therapies show several technical issues, especially regarding cell collecting, harvesting and in-vitro expansion before transplantation. Therefore, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) infusion can be an alternative and promising approach even though in-vitro and clinical studies are still few. Based on this evidence, the aim of this thesis work is to develop innovative in vitro models to study myogenic commitment of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSCs) by adopting two different approaches: (i) two-dimensional (2D) co-culture of human stem cells and PBMCs under dynamic conditions, such as perfusion; (ii) bioengineered three-dimensional (3D) co-culture of human stem cells and PBMCs. First, appropriate culture conditions, including culture medium composition and cell seeding ratio between hBM-MSCs and human primary skeletal myoblasts (hSkMs), were investigated using standard monolayer culture approaches. Cells cultured using medium supplemented with 10 ng/mL of b-fibroblast growth factor (b-FGF) and co-cultured with hSkMs showed higher myogenesis-related gene expression (Desmin, 141-fold; Myosin Heavy Chain II (MYH2), 32-fold) after 21 days, and a prevalent expression of anti-inflammatory cytokines (IL10, 15-fold; and IL4, 11-fold) rather than proinflammatory ones (IL1, 1.4-fold). Subsequently, PBMCs collected using a commercial filtration system commonly used in clinical practice were added in an upper transwell chamber to investigate their potential paracrine effects on myogenic events. Myogenic commitment of hBM-MSCs in the presence and absence of PBMCs was investigated by gene expression profiling by qRT-PCR and protein expression using immunofluorescence (IF) assay and flow cytometry. In the presence of PBMCs, hBM-MSCs significantly upregulated myogenic genes, such as Desmin and MYH2 starting at day 7 of culture, as confirmed by both qRT-PCR and IF, while pro-inflammatory cytokines (IL12A at day 14) were downregulated. Subsequently, myogenic commitment of hBM-MSCs was further implemented using a 3D approach employing fibrin-based scaffolds embedded with hBM-MSCs plus hSkMs with and without PBMCs, cultured in dynamic conditions using a perfusion bioreactor. This culture system appeared as a valid biomimetic environment for myogenic commitment of stem cells. Indeed, all myogenic-related genes tended to be upregulated in the presence of PBMCs, and Desmin and Myosin Heavy Chain were also detected at protein level. Moreover, the presence of PBMCs in 3D culture induced a significant downregulation of pro-inflammatory cytokine genes, such as IL6. This blood filtration system was structurally investigated by optical and electron microscopy, Fouriertransform infrared spectroscopy (FTIR), Differential Scanning Calorimetry (DSC), and Thermogravimetric analysis (TGA). We investigated filter membrane structure and their polymer compositions showing a characteristic morphological structure composed by polyhydroxy butyrate (PHB) polymer. Filtered PBMCs were characterized by flow cytometry immunophenotyping to confirm the efficacy of this filtration system in concentrating PBMCs in smaller volumes by simultaneously preserving their composition. In conclusion, our works confirm that hBM-MSCs represent a valid source of stem cells for skeletal muscle tissue engineering, as hBM-MSCs have a versatile myogenic potential, enhanced and modulated by blood filtered PBMC fraction co-culture. Moreover, our 3D biomimetic in vitro model better resembles physiological tissue architecture, improving stem cell survival and proliferation, and promoting complex biological in vivo cross-talks.

Le lesioni del muscolo scheletrico possono guarire spontaneamente, grazie al potenziale rigenerativo intrinseco garantito dalla presenza di un pool di cellule staminali residenti, conosciute come cellule satelliti. Dopo la lesione, le cellule satelliti quiescenti iniziano a proliferare e a differenziarsi verso cellule muscolari mature. Anche le cellule del sistema immunitario svolgono un ruolo centrale nel processo di rigenerazione del muscolo scheletrico, passando da un microambiente pro-infiammatorio ad uno anti-infiammatorio, a mano a mano che il processo di guarigione procede e il muscolo leso guarisce strutturalmente e funzionalmente. Tuttavia, il potenziale rigenerativo del muscolo scheletrico è limitato, soprattutto in caso di lesioni severe, con recupero incompleto e infiammazione cronica. Le terapie attuali sono limitate alla gestione conservativa delle lesioni muscolari, tra cui il protocollo RICE (riposo, ghiaccio, compressione e elevazione) e farmaci anti-infiammatori non steroidei o corticosteroidi intramuscolari per il sollievo dei sintomi infiammatori. Questi approcci non forniscono un ripristino completo allo stato pre-lesione, per questo motivo un nuovo approccio basato sulle terapie cellulari può rappresentare una valida opzione di trattamento. Tuttavia, queste terapie mostrano diversi problemi tecnici, come la raccolta ed espansione in vitro delle cellule prima del trapianto. L'infusione di cellule mononucleate da sangue periferico (PBMCs) può essere un altro approccio alternativo e promettente anche se gli studi in vitro e clinici sono ancora pochi. Sulla base di questa evidenza, lo scopo di questo lavoro di tesi è quello di sviluppare modelli innovativi in vitro per studiare il commitment miogenico delle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano (hBM-MSCs) adottando due diversi approcci: (i) co-coltura bidimensionale (2D) di cellule staminali umane e PBMCs in condizioni dinamiche, come la perfusione; (ii) sistemi bio-ingegnerizzati tridimensionali (3D) di co-cultura di cellule staminali umane e PBMCs. In primo luogo, sono state studiate le condizioni di coltura appropriate, tra cui la composizione del terreno di coltura e il rapporto di semina cellulare tra hBM-MSCs e le cellule muscolari primarie umane (hSkMs), utilizzando approcci standard di coltura monostrato. Le cellule coltivate con mezzo di coltura supplementato con 10 ng/mL di fattore di crescita fibroblast-like b (b-FGF) e co-coltivate con hSkMs hanno mostrato una maggiore espressione genica correlata alla miogenesi (Desmina, 141 fold; Catena pesante della Miosina 2 (MYH2), 32 -fold) dopo 21 giorni, e una prevalente espressione di citochine anti-infiammatorie (IL10, 15-fold; e IL4, 1-fold) rispetto a quelle pro-infiammatorie (IL1, 1,4-fold). Successivamente, i PBMCs raccolti tramite un sistema commerciale di filtrazione, comunemente usato nella pratica clinica, sono stati aggiunti al sistema di coltura attraverso un supporto transwell per studiare eventuali effetti paracrini sugli eventi miogenici. Il commitment miogenico di hBM-MSCs in presenza e in assenza di PBMCs è stato studiato tramite l'espressione genica tramite qRT-PCR e dall'espressione proteica con immunofluorescenza (IF) e citometria a flusso. In presenza di PBMCs, i hBM-MSCs hanno upregulato significativamente i geni miogenici, quali Desmina e MYH2 a partire dal giorno 7 di coltura, mentre le citochine pro-infiammatorie (IL12A al giorno 14) sono state downregulate. Successivamente, il commitment miogenico di hBMMSCs è stato ulteriormente implementato utilizzando un approccio 3D che impiega scaffolds di fibrina con hBM-MSCs più hSkMs con e senza PBMCs, coltivati in condizioni dinamiche utilizzando un bioreattore a perfusione. Questo sistema di coltura si è rivelato un ambiente biomimetico valido per il commitment miogenico delle cellule staminali. Infatti, tutti i geni relativi al fenotipo miogenico erano upregulati in presenza di PBMCs come anche Desmina e MYH2 sono state evidenziate anche a livello proteico. Inoltre, la presenza di PBMCs in coltura 3D ha indotto una downregulazione significativa delle citochine pro-infiammatorie. Questo sistema di filtrazione del sangue è stato studiato strutturalmente tramite microscopia ottica ed elettronica, spettroscopia infrarossa trasformata di Fourier (FTIR), calorimetria a scansione differenziale (DSC) e analisi termogravimetrica (TGA). La struttura della membrana filtrante e la relativa composizione polimerica mostra una struttura morfologica caratteristica composta dal polimero poliidrossi butirrato (PHB). Il fenotipo dei PBMCs filtrati è stato caratterizzato con citometria a flusso per confermare l'efficacia del sistema di filtrazione nella concentrazione dei PBMCs in piccoli volumi e conservando la loro composizione. In conclusione, questo lavoro di tesi conferma che le hBM-MSCs rappresentano una valida fonte di cellule staminali nell’ambito dell'ingegneria tissutale, poiché le hBM-MSCs mostrano un potenziale miogenico versatile, potenziato e modulato dalla co-coltura con i PBMCs filtrati. Inoltre, il nostro modello 3D biomimetico in vitro mima in maniera ottimale l’architettura dei tessuti fisiologici, migliorando la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule staminali e promuovendo complessi cross-talk biologici in vivo.